DNA连接
实验目的
掌握外源DNA片段和载体连接的方法。
实验原理
限制性内切酶可识别特定位点并切割 DNA 产生粘性末端或平端的外源片段，经 DNA 的纯化处理后用于连接反应；选择克隆载体多克隆位点上相应的限制性内切酶切割，并用碱性磷酸酶处理防止载体自连；在连接酶的作用下将外源片段连接到载体上，实现外源片段的克隆。
TA克隆：克隆载体用限制性内切酶酶切后，再在两侧的3端添加“T”。大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR产物的3末端添加“A”的特性。二者在DNA连接酶的作用下利用粘性末端进行连接。
仪器和材料
移液枪、pMD18-T Vector、DNA片段、solution I(内含T4 DNA连接酶)
实验步骤
- 在离心管中配制下列混合溶液，全量为5μl。（冰上操作）
| 成分 | 体积(μl) |
|---|---|
| pMD18-T Vector | 1μl |
| DNA | 1μl |
| H2O | 3μl |
- 加入5μl的solution I。（冰上操作）
- 16℃反应30min。
注意事项
- 吸取每一种试剂，必须用新的枪头，防止样品间污染。
- 加样准确，特别是pMD18-T Vector和DNA的加样量。