质粒DNA的提取

实验目的

  学习和掌握碱裂解法提取质粒；学习和掌握琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA的方法和技术。

实验原理

  碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0～12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互缠绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH 至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那木迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

  DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷在电场中向正极移动。由于糖－磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此他们能以相同的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的DNA， 也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。如上次实验提取的pUC19质粒，有3种构型：超螺旋的共价闭合环状质粒DNA(covalently closed circular DNA，简称 CCCDNA)；开环质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA 1条链断裂，（open circular DNA， 简称OCDNA）；线状质粒DNA ，即共价闭合环状质粒DNA 2条链发生断裂，（linear DNA，简称L DNA）。这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同。因此电泳后呈3条带，超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA和开环质粒DNA。

主要试剂

  1. 溶液Ⅰ
    50 mmol/L葡萄糖
    25 mmol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)Tris.HCl(pH 8.0)
    10 mmol/L乙二胺四乙酸Na(EDTA)(pH 8.0)

  2. 溶液 Ⅱ
    0.2mol/L NaOH（临用前用10mol/L NaOH 母液稀释）
    1% SDS，用前等体积混合（新鲜配制）

  3. 溶液 Ⅲ
    5mol/L 乙酸钾 60 ml
    冰乙酸    11.5 ml
    水      28.5 ml

  4. 70%乙醇（放-20℃冰箱中，用后即放回）

  5. RNaseA：将RNA酶溶于10 mmol/L Tris.HCl(pH7.5)、15 mmol/L NaCl中，配成10 mg／ml的浓度，于100℃加热15min，缓慢冷却至室温，保存于－20℃。

  6. LB+Amp培养基：LB液体培养基内加入100ug/mL的氨苄青霉素。注意Amp遇高温分解，待培养基温度低于60℃时加入。

  7. 50 x TAE：
    Tris       242g
    冰乙酸     57.1ml
    0.5 mol/L EDTA 100 ml
        pH 8.0

  8. 1%琼脂糖凝胶：称0.3g琼脂糖，放入250 mL三角瓶内，加入30 mL 1×TAE电泳缓冲液，加热煮沸等其冷至60℃左右，倒入封好的电泳板上。

  9. 10X Loading buffer

仪器耗材

  恒温摇床、冷冻离心机、移液枪一套、制冰机、三角瓶、Eppendorf管、试管、培养皿、试剂瓶、超净工作台、电泳仪、电泳槽、凝胶成像仪、微波炉。

实验步骤

1. 细菌扩大培养

  将5mL含Amp（100ug/mL）的LB液体培养基加入试管中，接入上述的含pMD18质粒的大肠杆菌（单菌落），37℃振荡培养过夜。

2. 质粒提取

（1）取培养物倒入1.5 mL离心管中，10000g 离心1 min。（分4次进行离心，每次1mL）
（2）倒出培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。
（4）加200 uL溶液 Ⅱ（新鲜配制），盖紧管口，颠倒混匀内容物(勿剧烈震荡)，将离心管放冰上5 min 。
（5）加入150 uL溶液 Ⅲ（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀。冰上放置5 min。
（6）14000g，离心15 min ，将上清转至另一离心管中。
（7）向上清中加入等体积酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），反复混匀，12000g，离心10 min，将上清转移到另一离心管中。
（8）向上清加入2倍体积乙醇和 1/10 体积的 NaAc(3 mol/L，pH5.2)，混匀后，室温放置15min。14000g离心10 min。倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。
（9）用500 μL 70% 乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心，倒去上清液，真空抽干或空气中干燥。
（10）加入适量（30 μL）的TE其中含有20 ug/ml RNA酶，使DNA完全溶解，－20℃保存。

3. 琼脂糖电泳检测

  将样品5uL与上样缓冲液混合，用移液枪将该混合样品加入样品孔（记录点样顺序及点样量），同时加入DNA marker，120v电泳大约20-30min。

作业

  1. 分析电泳图谱。
  2. 提取过程中，加入酚:氯仿:异戊醇的目的是什么？